STERILISATION ET STERILITE

Chapitre 1 Bases théoriques (1)

Définition de la stérilité et nature des agents infectieux à éliminer.

1) RAPPELS HISTORIQUES

« Si j’avais l’honneur d’être chirurgien, pénétré comme je suis des dangers auxquels exposent les germes des microbes répandus à la surface de tous les objets, particulièrement dans les hôpitaux, non seulement, je me servirais d’instruments d’une propreté parfaite et après les avoir soumis à un flambage rapide…, je n‘emploierais que de la charpie, des bandelettes et des éponges préalablement exposées à un air porté à la température de 130 à 150°, je n’emploierais qu’une eau qui aurait subi la température de 110 à 120° » On connaît tous cette phrase de PASTEUR qui est le père de la bactériologie et de la stérilisation. On connaît moins Nicolas APPERT qui fut un précurseur. Ce fut lui, le premier qui eut l’idée de passer les conserves alimentaires dans l’eau bouillante pour en assurer la conservation (le procédé est encore nommé « appertisation ») Ce procédé permit à un certain général BONAPARTE de disposer d’une armée bien nourrie et exempte de scorbut lors de la campagne d’Italie en 1795. (Un prix avait été proposé par le Directoire pour cette recherche) De là à imputer la victoire plus à APPERT qu’au génie militaire Corse… C’est d’ailleurs l’Empereur qui, en 1810, remit le prix de 12.000 F à Nicolas Appert. On savait empiriquement que des procédés comme les fumigations permettaient la conservation des aliments et empêchaient la putréfaction. On savait aussi que l’incinération des cadavres d’animaux empêchait de même les propagations de maladies, mais c’est seulement à partir de Pasteur et de l’identification des « microbes » (de « micros » et « bios », respectivement « petit » et « vie »)

On se rappelle l’extraordinaire expérience montrant l’inexistence du concept de « génération spontanée » que Pasteur décrivit dans le grand amphithéâtre de la Sorbonne. Voici en quoi a consisté cette expérience :

Un ballon était pourvu d’un mélange nutritif limpide (eau de levure sucrée) puis, porté à ébullition. Pasteur introduisit ensuite de l’air chaud calciné et scella le ballon au moyen d’un chalumeau. La solution est restée limpide.

Pasteur, deux mois après, a ouvert le ballon en y admettant de l’air calciné, mais en plongeant simultanément un petit tube ouvert avec un bouchon de coton, évidemment plein de particules et de poussières, puis rescella le ballon.

Le liquide alors s’est troublé et a fermenté. La fermentation ne se produit donc pas « spontanément », mais en présence de « germes » en suspension dans l’air… La microbiologie était née.

2) RAPPELS THEORIQUES

2.1) définition de la stérilité

«La stérilité est l’absence de microorganismes viables» La norme EN 285 définit l’état stérile comme « l’état d’un dispositif médical exempt de microorganismes »

Par extension, en raison de l’existence d’autres agents infectieux, on considère que les levures et champignons sont des « microorganismes » et pour les autres agents considérés comme non vivants, on dira que la stérilité est l’absence d’agents actifs. Du fait qu’il est impossible de vérifier la stérilité d’un objet sans lui faire perdre son caractère stérile, la stérilité est en réalité une notion de probabilité. On verra que l’absence absolue de microorganismes et autres agents n’existe pas, mais que les conditions pratiques de stérilisation ne laissent un nombre d’agents infectieux tellement faible qu’ils ne peuvent se développer et recouvrer leur pouvoir pathogène. Selon la norme EN 556, il doit y avoir une chance sur un million seulement que l’objet soit contaminé. On peut prendre des images de guerre pour illustrer la stérilisation : l’attaque d’un fortin. Plus il y aura d’assaillants, plus il y aura de survivants au tir des mitrailleuses. Cependant, même si les assaillants sont repoussés ou tués, il est impossible de « garantir » que TOUS les assaillants ont été tués. Il reste (heureusement) quelques survivants, mais en trop petit nombre pour retenter un assaut. Il en est de même des bactéries et autres agents infectieux…

2.2) Définition de la stérilisation

La stérilisation consiste à soumettre les agents infectieux à un procédé physique en vue de leur élimination et à rendre « stérile » (selon la définition précédente) la charge du stérilisateur (ou synonyme, d’un autoclave)

2.3) Efficacité de la stérilisation

Comme déjà écrit, le procédé choisi doit être tel qu’il n’y ait plus que une chance sur un million de trouver un objet non stérile, soit, de façon un peu ésotérique, une réduction à 6 logs (cf. annexe)

2.4) Conservation de l’état de stérilité

Une fois qu’un objet a été stérilisé, il faut qu’il soit dans un emballage qui lui conserve cet état de stérilité. (C’est la très grande différence entre la stérilisation et la désinfection) Ce dernier procédé ne permet pas de conserver l’état de « stérilité » immédiatement obtenue par l’action du désinfectant

C’est pourquoi, la plupart des objets à stériliser sont au préalable conditionnés dans un emballage perméable à l’agent stérilisant, mais imperméable à l’air dans les conditions normales de conservation.

Lorsque les produits à stériliser sont dans des emballages étanches (ex, conserves domestiques ou dans l’industrie pharmaceutique, les flacons de verre, emballages polyéthylène ou poche PVC) c’est, en quelque sorte l’emballage qui devient son propre autoclave et qui doit reproduire à l’intérieur les conditions de la stérilisation (temps, température et/ou pression, absence de spores)

3) NATURE DES AGENTS INFECTIEUX

Les agents infectieux sont
- les bactéries ;
- les levures et champignons ;
- les virus (N.B. (Les virus n’étant pas considérés comme des êtres vivants, on parlera dans ce cas d’inactivation)
- les prions (syn. : ATNC (Agents Transmissibles Non Conventionnels) responsables des maladies dégénératives du type CREUTZFZLD-JAKOB chez l’homme et chez l’animal de type EBS (Encéphalopathie bovine spongiforme), plus connue sous le nom de « maladie des vaches folles »

3.1) Notions sommaires sur les bactéries


Commençons par rappeler deux synonymes : « microbes » ou « germes » Il s’agit de cellules autonomes, composées comme les cellules « classiques » d’une paroi, (facultativement) d’une capsule, et d’un cytoplasme. Les bactéries sont dépourvues de noyau, mais sont pourvues d’ADN nucléaire
(les bactéries sont dites « protocaryotes », par opposition aux êtres plus évolués pourvus de noyau et dits « eucaryotes » du grec eu = bien) La figure 1 ci-dessous comprend tous les éléments constitutifs d’une bactérie mais ici, tous ne sont pas indispensables pour comprendre l’action des agents stérilisants. On distingue les bacilles (en formes de bâtonnets, cf. étymologie latine bacillus) et les cocci, en forme de sphère.
Pour l’antibiothérapie, ces notions sont importantes, notamment par rapport à la coloration que peuvent prendre les bactéries en présence de colorants pour leur identification (on connaît la classification en Gram + ou Gram -)
Figure 1 : structure d’une bactérie, (avec tous ses éléments « facultatifs »)
3.1.1) Les spores C’est une propriété exclusive des bacilles. Le bacille « se replie sur lui-même » et s’entoure d’une barrière résistante à la chaleur. Le bacille ainsi sporulé diminue ses besoins métaboliques et notamment son besoin en eau et ses échanges avec l’extérieur.
Si on peut se permettre la comparaison, les microbes sont comme les individus « repliés sur euxmêmes », ils sont peu coopérants…
Les micro-organismes sont sensibles à la chaleur (compris les formes sporulées, mais à haute température) mais cette sensibilité varie d’une espèce à l’autre. Le procédé de stérilisation choisi devra évidemment tenir compte des variations entre les espèces microbiennes et avoir l’efficacité souhaitable pour éliminer les espèces les plus résistantes. (flagelle, ADN nucléaire Capsule (porteuse de la virulence), plasmide, pili, Paroi bactérienne, ribosome, vacuole, cytoplasme

Il y a lieu d’éviter la formation de spores qui compromettent l’efficacité de la stérilisation Pour cela, le maintien de l’atmosphère humide est souhaitable, ce qui est le cas de la stérilisation par la chaleur humide. Dans le cas de stérilisations « sèches » comme la radiostérilisation et l’oxyde d’éthylène, il faut alors travailler à basse température.

3.2) Les levures et champignons
Les deux termes sont pratiquement synonymes. Les champignons et levure sont « eucaryotes » Si on connaît les champignons « à chapeau » ou en lamelle (genre cèpes ou girolles), on sait aussi qu’il existe des micro-champignons, non visibles à l’oeil nu. Ces micro-champignons sont tout simplement des cellules identiques à celles des champignons « classiques » mais qui n’ont pas réussi à se regrouper pour créer un appareil végétatif comme les champignons communs. Ils peuvent être responsables de maladies infectieuses redoutables comme certaines mycoses viscérales, notamment chez les sujets immuno-incompétents. (SIDA, greffés, cancers…)

3.2.1) Bactéries, nos amies ?
Ce titre provoquant avait été choisi par un chirurgien de Boucicaut dans les années 1970, le Pr. Raymond VILLAIN, pour rappeler, dans un dessin animé, que nous devions respecter les bactéries « utiles » (il ajoutait classiquement « paix sur les plaies aux germes de bonne volonté ! ») Que deviendrait le jus de raisin pressé, si des levures ne favorisaient pas la transformation des sucres en alcool, pour la plus grande joie de nos palais ? Si l’homme sain sait résister naturellement aux bactéries, il n’en est pas de même de l’homme malade ; celui-ci, affaibli par la maladie est plus facilement agressé par les agents infectieux. Autre cause d’affaiblissement des patients, l’intervention chirurgicale. En effet, l’ouverture de la peau casse la première carapace naturelle et a fortiori lors d’interventions viscérales avec des déséquilibres écologiques considérables (bactéries anaérobies au contact de l’air) Il est donc nécessaire, pour ne pas recontaminer le malade, que celui-ci soit opéré et soigné avec du matériel stérile (d’où la célèbre phrase de Pasteur mise en introduction)
3.3) Les virus
(Du latin, virus = poison) C’est Pasteur qui leur a donné ce nom ; les mots grecs « toxon »ou « pharmakon » étant largement utilisé avec « toxique»… et pharmacie, Pasteur s’est servi du terme latin jusqu’alors inusité.
A la suite de l’identification régulière des « germes », on comprit vite qu’il existait des maladies infectieuses « sans germes » Comme il était évidemment impossible de revenir à la théorie de la génération spontanée, Pasteur émit l’hypothèse d’agents responsables de trop petite taille pour être visibles au microscope, mais qui seraient identifiables par des moyens plus puissants que le microscope de la fin du XIXe siècle. C’est précisément ce qui arriva avec le microscope électronique du XXe siècle.

Nature du virus
Le virus est à la frontière du vivant et de l’organique. (figure 2) Leur caractère inclassable a fait dire à André Lwoff « les virus sont les virus » Il s’agit pour l’essentiel d’une capsule protéique, facultativement entourée d’une enveloppe lipoprotéique emprisonnant des ARN ou ADN qui peuvent infecter le noyau d’une cellule. Les virus soit d’ailleurs soit à ADN, soit à ARN ; il n’existe pas de cohabitation entre les deux formes d’acide nucléique

Figure 2 : Coupe transversale d’un virus (retirer l’enveloppe pour les virus « nus ») Il en résulte plusieurs conséquences :
- Le virus est un « être » frustre, ne pouvant que se développer sur des cellules ou tissus (les cultures en laboratoires sont sur oeuf incubé ou cultures de cellule)
- Il n’agit que s’il est entier. Un virus ayant perdu son enveloppe perd son pouvoir infestant (l’enveloppe est son « talon d’Achille »)
- Sa reproduction n’est pas de type sexuée (encore que celle des bactéries ne l’est pas non plus)
- Son mécanisme d’action est très intimiste (brins d’ADN ou d’ARN qui pénètrent le noyau d’une cellule et prennent la place de l’ADN ou ARN de la cellule) Les antiviraux (quand ils existent) ne doivent pas être toxiques pour la cellule infectée par le virus, mais pour le seul virus lui-même, et ce n’est que très récemment que l’on a mis au point des médicaments antiviraux, guère avant les années 1980 et l’épidémie de SIDA.
Les virus (et plus particulièrement les virus à enveloppe) sont toutefois sensibles à la chaleur et à des températures beaucoup plus basses que les microbes. Les procédés de stérilisation sont réputés « inactiver » les virus et non les « tuer » dans la mesure où ce ne sont pas des organismes vivants.
3.4) Les ATNC ou prions
Si les maladies dégénératives étaient connues depuis longtemps à des stades endémiques chez l’animal (tremblante du mouton) et chez l’homme, (maladie de Creutzfekld-Jakob) c’est évidemment l’épidémie de «vaches folles» qui a remis cette question à l’ordre du jour. Les « prions » sont mal connus. Il s’agit de petites protéines, assez curieusement dépourvues de pouvoir antigénique (parce que probablement protégées par une protéine enveloppante qui les masque aux anticorps anti-prions)
Les prions résistent aux agents mécaniques classiques et ne sont « détruits » (ou inactivés) que dans des conditions drastiques de température ou de trempage dans des solutions corrosives comme la soude normale ou l’eau de javel fortement concentrée. On pensait que le prion infestait seulement les tissus nerveux ou ophtalmiques. On estime aujourd’hui qu’il existe des « nouveaux variants » pouvant se loger dans les ganglions, le tube digestif…

4) CROISSANCE ET MORT DES MICRO-ORGANISMES
Les phénomènes de croissance et de mort des agents infectieux est capital pour comprendre l’objectif recherché par la stérilisation. La croissance des bactéries est du type exponentiel (cf. annexe) et répond à la formule générale
N = No ekt (la formule se lit « n égale n-zéro, e puissance kt)
N = nombre de bactéries présentes ;
No= nombre de bactéries initiales au début de l’observation (au temps t = 0) ; Enveloppe (le cas échéant)
Acide nucléique
Capside

e = 2,721828… base des fonctions exponentielles ;
k = coëfficient, fonction de l’espèce bactérienne ;
t = temps de croissance observé.
En français, quand on dit que « la croissance d’une population donnée (ou tout autre phénomène) est proportionnelle à la population initiale » Cela veut dire que nous avons affaire à un phénomène exponentiel.
Autrement dit, (figure.1) plus No est important, plus la croissance sera rapide.
Note : voir en annexe, si nécessaire, le chapitre « logarithmes et exponentielles »


On peut également représenter cette même fonction exponentielle par une fonction puissance de 10 ; soit N = No 10 kt qui a la même allure générale. Cette représentation a l’avantage de pouvoir être convertie en logarithmes décimaux qui donne une droite sur papier semi-logarithmique. (figure 2) Attention à l’interprétation, l’ordonnée ne passe JAMAIS par la valeur 0 !


On s’intéresse classiquement, pour évaluer la croissance bactérienne, au nombre de générations à l’heure, (ainsi Escherichia Coli à 37° a une croissance de 3 générations à l’heure) ce qui correspond à peu près à un doublement de la population toutes les 28 minutes. Toutefois, la croissance des bactéries n’est pas infinie et la population arrive à un plateau où on a une décroissance exponentielle des bactéries, mais qui sont elles-mêmes remplacées à une vitesse exponentielle par de nouvelles générations.